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Logo of nihpaAbout Author manuscriptsSubmit a manuscriptHHS Public Access; Author Manuscript; Accepted for publication in peer reviewed journal;
 
Angew Chem Weinheim Bergstr Ger. Author manuscript; available in PMC 2017 April 18.
German.
Published in final edited form as:
PMCID: PMC4946795
NIHMSID: NIHMS764730

Leichte Neucodierung von Selenocystein in der Natur

Facile Recoding of Selenocysteine in Nature

Abstract

Selenocystein (Sec oder U) wird durch Neuzuordnung des Stopp-Codons UGA durch einen Sec-spezifischen Elongationsfaktor und eine charakteristische RNA-Struktur codiert. Um mögliche Codonvariationen zu finden, analysierten wir 6.4 Billionen Basenpaare metagenomischer Daten sowie 24903 mikrobielle Genome für tRNASec-Spezies. UGA ist erwartungsgemäβ das vorherrschende Codon für Sec, allerdings finden wir auch tRNASec-Spezies, die die Stopp-Codons UAG und UAA erkennen, sowie weitere zehn Sense-Codons. Die Synthese von Selenoproteinen durch UAG in Geodermatophilus und Blastococcus sowie durch das Cys-Codon UGA in Aeromonas salmonicida konnte durch metabolische Markierung mit 75Se oder Massenspektrometrie bestätigt werden. Weitere tRNASec-Spezies mit verschiedenen Anticodons ermöglichten es Escherichia coli, die aktive Form des Selenoproteins Formiatdehydrogenase H zu synthetisieren. Der genetische Code ist damit bedeutend flexibler, als bisher angenommen.

Graphical abstract

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Das Spurenelement Selen findet sich in zellulären Proteinen als Bestandteil der 21. Aminosäure Selenocystein wieder. In dieser ist die Thiolgruppe des Cysteins durch eine Selenolgruppe ersetzt.[1] Obwohl so genannte Selenoproteine in allen drei Domänen des Lebens[2] zu finden und sogar in Säugetieren essenziell sind,[3] enthalten Pflanzen und Pilze kein Sec. Diese Aminosäure ist ein essenzieller Teil des aktiven Zentrums vieler Redox-Enzyme.[4] Während der Translation von Selenoprotein-codierender mRNA wird das traditionelle Stopp-Codon UGA[5] durch die spezifische Interaktion mit dem Elongationsfaktor SelB (in Bakterien) und einer spezifischen mRNA-Sequenz umprogrammiert.[5,6] Vor kurzem ist es einer Forschergruppe als Teil einer synthetisch-biologischen Studie gelungen, in E. coli eine Vielzahl von Sense- und Stopp-Codons Sec zuzuordnen.[7] Zudem konnte sie demonstrieren, dass diese Veränderungen des genetischen Codes toleriert werden. Diese Beobachtung führt zu der Frage, ob diese Abweichungen von der standardmüßigen Zuordnung von UGA zu Sec möglicherweise auch natürlich vorkommen.

Bei einer Computer-basierten Suche innerhalb mehrerer Billionen Basenpaare metagenomischer Daten konnte eine große Anzahl von umprogrammierten Stopp-Codons in Bakterien und Bakteriophagen identifiziert werden.[8] Dies veranlasste uns dazu, eine umfassende Suche durch verfügbare metagenomische und mikrobielle Genome nach Anticodon-Varianten der typischen tRNASecUCA, der längsten tRNA[9] mit einer untypischen Tertiärstruktur,[10] durchzuführen. Eine BLAST-Suche der tRNADB-CE-Datenbank[11] identifizierte vier tRNASecCUA-Sequenzen, was dafür spricht, dass diese das UAG-Codon erkennen. Eine Durchmusterung aller öffentlich zugänglichen mikrobiellen Genome des National Center for Biotechnology Information (NCBI) und aller assemblierten metagenomischen Daten des Integrated Microbial Genomes (IMG) Systems[12] führte zu einer tRNASecGCA-Gruppe, die möglicherweise das UGC-Codon erkennt. Weiterführend entwickelten wir ein generelles Computer-basiertes System, das 6.4 Tb nicht assemblierter kurzer Sequenzen und 180 Gb assemblierter Contigs (> 2 kb) sowie 24903 mikrobielle Genome des IMG durchsuchte (Abbildung 1 A). Die erhaltenen Ergebnisse bestätigten, dass UGA das vorherrschende Sec-Codon ist. Zusätzlich sind zwölf verschiedene tRNASec-Anticodonvarianten in der Lage, die Stopp-Codons UAG und UAA zu erkennen, und weitere zehn Sense-Codons konnten bestimmt werden (Abbildung 1 A). Zusätzliche Sequenzvalidierungen bestätigten, dass diese tRNASec-Varianten keine Sequenzierungsartefakte sind (siehe Hintergrundinformationen).

Abbildung 1
Nichtkanonische Zuordnung von Selenocystein in der Natur. A) Der Computer-basierte tRNASec-Suchprozess und manuell geordnete Ergebnisse. Die nichtkanonischen tRNASec-Sequenzen sind durch ihre Codon-Erfassung gruppiert; deren Anzahl und vermutlicher bakterieller ...

Wir gruppierten diese nichtkanonischen tRNA-Spezies nach der Art des Anticodons, ihrer Sequenz und strukturellen Gemeinsamkeiten (Abbildung 1A und Hintergrundinformationen). Die größte Gruppe (Anticodon CUA) enthält 366 nahezu identische tRNASec-Sequenzen der actinobakteriellen Geodermatophilaceae-Familie (Abbildung 1A,B, links),[13] während die anderen drei tRNASecCUA-Spezies von Rhizosphären-bakteriellem Ursprung sind. Die tRNASecCUA-Spezies machten 3 % der tRNASec-Spezies in der Boden-Metagenomprobe 3300001205 aus.

Die nächste Gruppe enthält tRNASec-Spezies (mit dem Anticodon GCA, das Cys codieren kann) der Betaproteobakterien und Darmsymbionten von Termiten (Abbildung 1 A; Abbildung S3 der Hintergrundinformationen). Zwei Aeromonas-salmonicida-Genome enthalten eine tRNASecACA, die das UGU-Cys-Codon decodieren kann. Die anderen 16 Mitglieder dieser Gruppe stammen aus Chloroflexi (Abbildung S4) und marinen Bakterien (Abbildung S5). Die beiden tRNASecUUU/CUU (erkennen AAA/AG-Lys-Codons) stammen wahrscheinlich von Solirubrobacterales (Abbildung S6). Zusatzliche tRNASec-Varianten, die in der Lage sind, das Stopp-Codon UAA und die sechs Sense-Codons (CGA, AGA, GGA, UUA, UCA, UGG) zu erkennen, wurden ebenfalls identifiziert (Abbildung S7).

Als nächstes wollten wir das Codierungspotenzial dieser nichtkanonischen tRNASec-Spezies bestätigen. Die Selenoproteinsynthese lässt sich durch drei Strategien überprüfen:

  1. Metabolische Markierung der Organismen mit 75Se;
  2. Ersetzen von Teilen der E.-coli-Selenoproteinsynthese-Maschinerie durch Gene und tRNASec, die wir in den genomischen und metagenomischen Daten identifiziert haben;
  3. Ersetzen der E.-coli-tRNASec durch die neu identifizierten tRNASec-Spezies.

Die beiden letzten Strategien nutzen die Synthese der E.-coli-Formiatdehydrogenase H (FDHH, codiert durch das fdhF-Gen) als Reporter.[7]

Um den UAG-bestimmten Einbau von Sec zu bestätigen, ließen wir Zellen von Geodermatophilus obscurus G-20 und Blastococcus saxobsidens in Gegenwart von [75Se]Selenit wachsen und konnten in der Folge radioaktiv markierte Selenoproteine mit einer Größe von 140 und 50 kDa detektieren. Die Genomsequenzen dieser Organismen sagen das Vorhandensein von Formiatdehydrogenasen (FDHs) (Abbildung S8, Tabellen S1,S2) und UGSC-Motiv-Proteinen[14] (Abbildungen S1,S8, Tabelle S3) voraus. Zusammengefasst war dies der erste Hinweis auf eine UAG-Umcodierung durch Sec, die zur erwarteten Synthese von FDH (FdxG) und den UGSC-Motiv-Proteinen führt. Die Zellextrakte wurden anschließend durch SDS-PAGE aufgetrennt und die Proteine der Größe von 140 und 50 kD aus dem Gel ausgeschnitten, trypsiniert und durch Flüssigkeitschromatographie mit gekoppelter Tandem-Massenspektrometrie (LC-MS/MS) analysiert. Das 140-kD-Gelstück enthielt Volllängen-FdxG Das 50-kD-Gelstück von G. obscurus enthielt ein UGSC-Motiv-Protein (Abbildung 2 A; Tabelle S4).

Abbildung 2
Umcodierung von UAG- und Cystein-Codons zu Selenocystein. A) Metabolische Markierung von G.-obscurus- und B.-saxobsidens-Zellen mit 75Se. Zellextrakte wurden durch SDS-PAGE aufgetrennt, und ihre mutmaßlichen Selenoproteine wurden durch die Analyse ...

Vergleichbar mit E. coli codiert das G.-obscurus-Genom[13b] die Gene selA, selB, selC und selD der Sec-Einbaumaschinerie. In Bakterien produziert SelD den Se-Donor Selenphosphat, SelA überführt Ser-tRNASec (die tRNA ist das Produkt des selC-Gens) in Sec-tRNASec, und SelB bringt die Sec-tRNASec abhängig von der Selenocystein-Insertionssequenz (SECIS) zum Ribosom. Um die Funktionalität von SelA, SelB und SelC zu testen, komplementierten wir den E.-coliselABCfdhF-Stamm ME6 mit den G.-obscurus-selABC-Genen. Das Produkt des E.-coli-Gens fdhF ist das Selenoprotein FDHH (Tabelle S1), das für seine Aktivität Sec an der Position 140 benötigt.[15] Das Ersetzen von Sec durch Cys führt zu einer 300-fachen Verringerung der FDHH-Aktivität.[16] Katalytisch aktive FDHH lässt sich leicht durch die Reduktion von Benzylviologen identifizieren, was zu einer violetten Verfärbung führt.[17] Als Reporter nutzen wir eine E.-coli-fdhF-Variante mit einem UAG-Codon in Position 140 und einem G.-obscurus-SECIS-Element. Dies führte zu einer FDHH-Variante mit zwei veränderten Aminosauren (Abbildung 2B). Dieses Reportergen wurde in das pRSF-Plasmid kloniert und in den ME6-Stamm transformiert. Die Expression der G.-obscurus-selABC-Gene in diesem veränderten Stamm produziert die aktive FDHH (Abbildung 2 B). Diese Daten bestätigen, dass das UAG140-Codon in dieser E.-coli-FDHH-Variante Sec neu zugeordnet wurde.

UGU(Cys)-Neuzuordnung in Aeromonas salmonicida Subsp. pectinolytica 34mel,[18] einem Stamm der γ-proteobakterium-A.-salmonicida-Subspezies, konnte bereits bestätigt werden. Im Unterschied zu anderen Aeromonas-Spezies paaren die pectinolytica-Subspezies und der Stamm Y577[19] die tRNASecACA mit dem UGU-Cys-Codon in fdhF. Die anaerobe metabolische Markierung von pectinolytica-Zellen mit 75Se führte, zusätzlich deren In-vivo-FDH-Aktivität (Abbildung 2C), zu radioaktiver FDHH (Abbildung 2D). Wir bestätigten durch Überexpression von einem Plasmid und LC-MS/MS-Analyse (Abbildung 2E, Tabelle S4) den UGU140-vermittelten Sec-Einbau in FDHH. Das detektierte Selenopeptid (LC-Retentionszeit 24.82 min) hat die korrekte Masse (Abbildung S9) und das zu erwartende sekundäre Fragmentierungsschema (Abbildung 2F). Die coeluierenden Cys- und Sec-Peptide konnten anhand ihrer verschiedenen Massen mit Ionenintensitäten von ca. 100:1 unterschieden und detektiert werden (Abbildung S9A). In Proteinproben von pectinolytica-Zellen, die eine fdhF-Variante exprimieren, der das SECIS-Element fehlt, konnten keine Massenpeaks von Sec-Peptiden nachgewiesen werden (Tabelle S4). Diese Daten zeigen, dass in A. pectinolytica 34mel das Cys140-Codon des fdhF-Gens SECIS-abhängig als Sec translatiert wird.

Die UGC-Neuzuordnung von Cys zu Sec durch tRNASecGCA ist möglicherweise ein typisches Merkmal von Burkholderiales. In langen metagenomischen Contigs von Burkholderiales ist das selC-Gen flankiert von den Genen selB und selA. Das selABC-Operon befindet sich neben dem Formiatdehydrogenase-Gen (fdoG), an dessen UGC-Cys-Codon im aktiven Zentrum sich ein putatives SECIS-Motiv anschließt. Der E.-coli-ΔselABC-Stamm wurde durch die Burkholderiales-selAB- und selC-opal-Contig-Varianten sowie die E.-coli-fdhF-Variante, die das Burkholderiales-SECIS-Element-Contig enthält, komplementiert (Abbildungen 1B, rechts, und 2 G). Dieser Stamm produzierte die aktive Form der FDHH (violette Farbe; Abbildung 2H, zweite Reihe). Im Falle eines inaktiven SECIS-Elements, das eine G25C-Mutation enthielt, konnte keine FDHH-Aktivität nachgewiesen werden, und die Zellen blieben farblos (Abbildung 2H, Reihe 4). Wir veränderten in Kombination mit dem Burkholderiales-selC-Contig das UGA140-Codon zu UGC für die chimären fdhF-Varianten, die entweder ein aktives oder ein inaktives SECIS-Element enthielten. Da das FDHH-Cys140-Enzym eine klare Farbveränderung nach Violett zeigte (Abbildung 2H, Reihen 1 und 3), bestätigten wir das funktionelle SECIS-Element durch 75Se-Markierung (Abbildung 2H). Diese Daten zeigen, dass die Burkholderiales-Contigs selA und selB, tRNASecGCA sowie das SECIS-Element das UGC-Codon in E. coli neu zuordnen können.

Wir testeten auch die metagenomischen tRNASec-Varianten, die andere Stopp- und Sense-Codons erkennen, bezüglich einer Sec-Neuzuordnung. Wir wählten eine repräsentative metagenomische tRNASec-Spezies für jedes Anticodon und exprimierten diese zusammen mit E.-coli-fdhF-Varianten mit dem entsprechenden kognaten Codon an Position 140 im E.-coliselCfdhF-Stamm.[7] Überraschenderweise führten alle getesteten tRNASec-Spezies, bis auf tRNASecUCC, zur Neuzuordnung der betreffenden Codons zu Sec, was wir durch ihr Potenzial zur Produktion einer aktiven FDHH-Form in E.-coli-Zellen demonstrieren konnten. Es sollte erwähnt werden, dass die Neuzuordnung von GGA in unseren früheren Sec-Studien nur schlecht funktioniert hatte.[7] Diese verschiedenen Effizienzen sind möglicherweise auf Veränderungen der idealen SECIS-Element Struktur durch das Upstream-Codon zurückzuführen.[20] Auf Grundlage dieser Befunde glauben wir, dass diese tRNASec-Spezies möglicherweise dazu genutzt werden, Sense-Codons in ihren ursprünglichen Organismen neu zuzuordnen.

Wie sieht dies in eukaryotischen Organismen aus? Wir haben zwar neun tRNASec-Varianten in Algen gefunden (zwei sind in Abbildung S7 dargestellt), jedoch erfordern sie noch eine weitere Validierung, da sie fast identisch mit kanonischen tRNASec-Spezies sind. Bei einer ähnlichen Durchmusterung von 92 Säugetiergenomem (215 Gb) sowie vom Genom von Drosophila melanogaster (139 Mbp) konnte keine Ausnahme für UGA als Sec-Codon gefunden werden. Daher ist weiter zu untersuchen, ob dieser Befund damit zusammenhängt, dass Selenoproteine essenziell in Redox-Signalwegen sind[21] oder für ein hochentwickeltes Backup-System zur Verfügung stehen.[22] Allerdings agiert UGA sowohl als Cys- wie auch als SECIS-äbhangiges Sec-Codon im niederen Eukaryoten Euplotes crassus.[23]

Bisher konnte keine natürlich vorkommende Neuzuordnung von Sense-Codons in Bakterien beobachtet werden. Von mitochondrialen Genomen ist jedoch bekannt, dass Codons, die ihre ursprüngliche Zuordnung verloren haben, andere Aminosäuren insertieren.[24] Der hier beschriebene Fall ist anders; die Sec-Insertion wird durch ein SECIS-Element vermittelt und führt dadurch zu einer dualen Nutzung des gleichen Codons für eine andere Aminosäure (durch Paarung mit tRNASec-Varianten, die das richtige Anticodon enthalten).

Was könnte für die leichte natürliche Neuzuordnung von Sec verantwortlich sein? Der Einbau von Sec weicht deutlich von dem anderer Aminosäuren ab und wird durch ein eigenes, orthogonales System ermöglicht,[5] das aus einem anderen Elongationsfaktor (SelB), einem benötigten SECIS-RNA-Element, einer strukturell ungewöhnlichen tRNA (tRNASec),[10] dem dualen Stopp-Codon (UGA) und dem Release-Faktor 2 (RF2) besteht. Diese Tatsache lässt darauf schließen, dass die Sec-Neuzuordnung möglicherweise keine generellen Auswirkungen auf die Proteintranslationsmaschinerie hat, wie man dies für die Neuzuordnung von kanonischen Sense-Codons annehmen könnte.[25] Die leichte Neuzuordnung von Cys zu Sec ist möglicherweise eine Konsequenz aus der Kombination von oft wünschenswerten Eigenschaften von Selenenzymen und Selenoproteinen, wie neue Redox-Funktionen oder erhöhte Enzymaktivität,[4,26] wobei die Möglichkeit erhalten bleiben soll, die Cys-Proteine und -Enzyme weiter normal zu exprimieren. Unsere Studien der natürlichen Sec-Neuzuordnung sprechen für die mögliche Existenz anderer Codierungsschemata und bekräftigen die Einschränkungen von vorhandenen, Computer-basierten Programmen zur Vorhersage von Selenoproteinen aus Genomsequenzen, da diese Algorithmen auf UGA als einzigem Sec-Codon beruhen.

Unsere Studie liefert neue Belege für eine begrenzte, aber eindeutige Formbarkeit des genetischen Codes, dessen Geheimnisse immer noch in den unsequenzierten Organismen verborgen liegen.

Supplementary Material

Supporting Information

Acknowledgments

Wir danken Andreas Brune, Filipa Gody-Vitorino, Hans-Peter Klenk, Ryan Lynch, Katherine McMahon, Daniel Marcus, William Mohn, Len Pennacchio und Ameet Pinto für die Erlaubnis, unveröffentlichte Sequenzdaten zu verwenden, die durch das DOE-JGI's Community Sequencing Program produziert wurden. Weiterhin danken wir Hans Aerni, Patrick O'Donoghue, Jean Kanyo, Jiqiang Ling, Jesse Rinehart und Oscar Vargas-Rodriguez für Diskussionen und praktische Ratschläge sowie Daniel Drell und Robert Stack für Ermutigung. Diese Arbeit wurde unterstützt vom NIGMS (GM22854 an D.S.) und der CSGB Division, Office of Basic Energy Sciences of the Department of Energy (DE-FG02-98ER20311 an D.S.; zur Förderung der genetischen Experimente). Die Arbeiten im U.S. Department of Energy Joint Genome Institute, a DOE Office of Science User Facility wurden unter der Vertragsnr. DE-AC02-05CH11231 unterstützt.

Contributor Information

Takahito Mukai, Department of Molecular Biophysics and Biochemistry Yale University, New Haven, CT 06520 (USA)

Markus Englert, Department of Molecular Biophysics and Biochemistry Yale University, New Haven, CT 06520 (USA)

H. James Tripp, Department of Energy Joint Genome Institute (DOE JGI), Walnut Creek, CA 94598 (USA)

Corwin Miller, Department of Molecular Biophysics and Biochemistry Yale University, New Haven, CT 06520 (USA)

Natalia N. Ivanova, Department of Energy Joint Genome Institute (DOE JGI), Walnut Creek, CA 94598 (USA)

Edward M. Rubin, Department of Energy Joint Genome Institute (DOE JGI), Walnut Creek, CA 94598 (USA)

Nikos C. Kyrpides, Department of Energy Joint Genome Institute (DOE JGI), Walnut Creek, CA 94598 (USA)

Dieter Söll, Department of Molecular Biophysics and Biochemistry Yale University, New Haven, CT 06520 (USA); Department of Chemistry, Yale University, New Haven, CT 06520 (USA)

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