PMCCPMCCPMCC

Search tips
Search criteria 

Advanced

 
Logo of bactLink to Publisher's site
 
Bacteriophage. Jan 1, 2012; 2(1): 1–4.
PMCID: PMC3357380
Professor Dr. Richard Bruynoghe
A 1951 overview of his bacteriophage research spanning three decades
Rob Lavigne 1 * and Johan Robben 2
1Division of Gene Technology; Katholieke Universiteit Leuven; Leuven, Belgium
2Biochemistry, Molecular and Structural Biology Section; Katholieke Universiteit Leuven; Leuven, Belgium
*Correspondence to: Rob Lavigne; Email: rob.lavigne/at/biw.kuleuven.be
In 1921, Richard Bruynoghe and his student Joséph Maisin published on the first use of bacteriophages in a phage therapy context. At that time, Bruynoghe (a medical doctor) was affiliated as a professor at the KU Leuven (Belgium) for just over a decade, within the Bacteriological Institute which he founded and led. After a distinguished career (he was acting mayor of the city of Leuven-Belgium during the second World War), he received a special medical award in 1951 just before his retirement in 1952. In this perspective, he was asked to provide an overview of his research for a lay-audience within the local University magazine: Onze Alma Mater (Our alma mater). We, as current affiliates of the KU Leuven are honored to present some of his legacy, which to date has been largely overlooked in historical accounts.
Keywords: bacteria, bacteriophages, historical overview, phage biology, phage therapy
The text itself indeed offers a clear and well argumented case which defines the diversity of phage in nature and reflects the existing discussions between the renowned researchers in this budding research field. A clear advocate of the Delbrück school of thought on the existence of the bacterial virus (contrary to Bordet’s views), his results obviously stem from his experimental work on lytic bacteriophages. The views of Bruynoghe are excellently summarized in the final paragraph of his manuscript, which offers a nuanced and critical view of the role of bacteriophages in medicine and the environment in general. From that perspective, his conclusions can be considered as surprisingly accurate, even by today’s standards. See Figure 1.
Figure 1.
Figure 1.
Richard Bruynoghe (A) was affiliated as a professor at the K.U.Leuven within the Bacteriological Institute (B). He provided an overview of his research for a lay-audience within the local University magazine, Onze Alma Mater (C).
In the bacteriological institute, investigations of a scientific nature are performed, besides the investigations which directly benefit our patients. It is difficult to determine the scale of these activities.
In recent times, analyses of a clinical nature have increased strongly. It no longer suffices to determine the nature of the infective bacteria, often their susceptibility towards antibiotics (penicillin, streptomycin, aureomycin, chloromycetin,…) has to be determined. Add to this the numerous serological tests, requested by the hospital and doctors. To give you an idea about the work being performed, I should point out that we weekly perform about two hundred Bordet-Wassermann reactions [antibody test for Syphilis], eighty Rhesus determinations [blood typing] and numerous Widal reactions [diagnosing Typhoid fever], Wright stain [blood cell type differentiation], etc.
Our scientific research aims at gathering new information on various puzzles or to confirm recent discoveries of interest to us. So many topics have been studied within the Bacteriological institute, that it’s impossible to fully report on all of them. This is why it’s my pleasure to summarize our bacteriophage research. This research led to my 1931 prize for Medicine, which is awarded every five years.
The bacteriophage was discovered by Twort (1915) and d’Herelle (1917). These scientists observed that filtrates of certain cultures had the capacity to inhibit growth of specific bacteria for a certain time. According to d’Herelle this inhibition was caused by a virus which penetrates into the bacteria to make them sick. Professor J. Bordet had a different take on this phenomenon: according to him these filtrates damaged the bacteria, producing an autolytic ferment.
We have always considered bacteriophages as viruses and have observed that:
1. Contrary to the assumption made by d’Herelle, who thought a single bacteriophage existed that could adapt to various bacteria, we observed that many bacteriophages exist, which differ from each other like microbes do
We have come to this view because microbes which have become resistant against a certain phage, can still be inhibited in their growth, just like normal microbes, by another phage. Since this observation was also made in opposite direction, one had to assume the multiplicity of phages. Since this observation also was done in the opposite direction, the multiplicity of phages had to be accepted. To make this easier for you to understand, I should note that in 1921 we had two phages which inhibited the growth of the same Typhoid culture. The Typhoid culture which had become resistant against bacteriophage L (hence in its presence grew as on normal media) was inhibited in its growth by bacteriophage St. Since we could observe the same phenomenon in the opposite direction (i.e. the Typhoid culture, resistant against St, was inhibited by bacteriophage L), this could only be explained by the multiplicity of phages.
If this had occurred only in one direction, one could have explained the observation by assuming that one of the phages was more active than the other. However, in view that the growth inhibition occurred in both directions, this could only be explained by assuming that both phages are different, like the Typhoid culture differs from the paratyphoid bacteria.
Persons, cured from typhoid infection [Ebert’s bacillus (tubercle bacilli)], are no longer susceptible to this microbe, but can still be infected by the paratyphoid bacillus. Similarly, persons cured from paratyphoid infections still can be infected by Typhoid, simply because we are dealing with two different microbes.
We have also proved the diversity of phages by neutralisation experiments. An animal, injected with phage L., produces an immune serum which neutralises this phage in such a way that growth of the microbes is no longer inhibited. This occurrence is specific, such that the immune serum only neutralizes the bacteriophage used for immunisation.
The resistance of phages against heating also supports their multiplicity. Scientists have obtained different results: one claimed that a heat treatment at 60°C for one hour destroyed the phages; others found larger resistance and noticed phages could withstand heating at 70°C. We have explained these results by demonstrating that these experiments were not carried out by one and the same phage.
2. The multiplicity of phages implied that phages isolated with normal techniques often have a complex composition
(To isolate phage one adds, e.g., rincing water to broth. After 24 hours of incubation, the obtained culture is filtered in a porcelain filter, which retains the bacteria but let through the phages (virus). This filtrate has the above-mentioned properties: it inhibits susceptible bacteria, at least temporarily, in their growth).
We have observed this by neutralisation experiments. A serum obtained from animals which were immunized against bacteriophage A, neutralized this as well as another phage (which we indicate as B). The latter, injected into rabbits, produced a neutralising serum against bacteriophage B, but not against phage A. One may explain this if one assumes that bacteriophage A has a more complex composition, and includes, among others, bacteriophage B.
This complex make-up of certain bacteriophages has also been shown by heating experiments; bacteriophages heated to 65 degrees for one hour often show a simpler composition compared to phages heated at lower temperatures. This can be explained by the destruction of some sensitive phages. For this reason, the immune serum obtained by injecting animals with phages heated at higher temperatures, was not capable to neutralize the original phages. We should add that we have pointed out a technique to count phages in cultures. Their number usually ranges between 10 and 100 million per cubic centimetre. If one exceeds the dilution where no phages are found per cubic centimetre, then one will not find any phages in one or another cubic cm. This is because phages are corpuscular elements, which, once their maximal dilution is reached, can no longer spread in a homogenous fashion.
3. In our investgations we could also demonstrate the independence of phages
For example, a phage, cultured in symbiosis with coli bacilli, remains the same when it is co-cultured with entirely different microbes, like typhoid, paratyphoid and paradysenteric bacilli, etc. This would not occur if phages, as claimed by Professor J. Bordet, were a secretion product of microbes; in that case, their properties would shift in relation to the origin of the microbes, which is not the case if the phage remains independent. Similarly, we have observed that microbes infecting animals maintain their autonomy even when they infect humans. All these observations have contributed significantly to acceptance of the “bacteriophage-virus” concept.
We have, moreover, done other observations to support this view. We’ve noted that phages possess a power to adapt against harmfull influences, like heating at high temperature, like the impact of concentrated glycerin. Adaptability definitely is a characteristic of something alive.
Let us add to this that, since the introduction of the electron microscope, one has been able to assess the multiplicity of bacteriophages.
Furthermore, this view fits well with general biology. It would a peculiar phenomenon if nature only contained pathogenic bacteria against humans, animals and plants. For some disease-causing microbes, we have numerous saprophytic germs which are of use to man, or even essential to his existence.
Bacteriophages are now saprophytic viruses which are also useful to us. However, one should not exaggerate their role, like d’Herelle did, and attribute the recovery of illnesses to phages only. According to d’Herelle, immune substances which form during the disease course, are not the cause of the cure, but its consequence. Although we consider bacteriophages as useful to us in certain cases, we’ve never taking this exaggerated point of view. Certainly, these phages do play an important role in the destruction of germs which are spread with the faeces on the earth, in the water, etc., in other words, in the self purification occurring in nature.
Op 6 Mei 1951 werd Prof. Dr. R. Bruynoghe te Leuven tijdens een academische zitting gevierd bij gelegenheid van zijn veertig jaren professoraat.
De befaamde geleerde was zo welwillend, op ons verzoek, aan « Onze Alma Mater » volgende nota te bezorgen over zijn opzoekingen.
In het Bacteriologisch Instituut, worden naast de onderzoekingen, gedaan ten bate van de zieken, steeds opzoekingen van wetenschappelijke aard uitgevoerd.
Het is moeilijk de omvang van deze beide soorten werkzaamheden te bepalen.
In de laatste tijd zijn de onderzoekingen van klinische aard fel gestegen. Het volstaat thans niet meer de infectiemikroben te bepalen, in menige gevallen vraagt men ons ook hun gevoeligheid tegenover de antibiotica (penicilline, streptomycine, aureomycine, chioromycetine, enz.) te bepalen. Voegt daarbij nog de talrijke serologische proeven, die op aanvraag van kliniek en dokters dienen uitgevoerd te worden. Om een idee te geven van het werk dat op dit gebied te verrichten is, moet ik er slechts op wijzen dat wij wekelijks rond de tweehonderd Bordet-Wassermann-reacties, rond de tachtig Rhesusbepalingen en tal van Widalreacties, Wrightproeven, enz. uit te voeren hebben.
De wetenschappelijke navorsingen hebben voor doel nieuwe gegevens nopens het ene of andere vraagstuk te verkrijgen of soms ook eenvoudig de ene of andere ontdekking na te gaan.
In het Bacteriologisch Instituut werden reeds zoveel onderwerpen bewerkt, dat het totaal onmogelijk is over al die uitgevoerde onderzoekingen een volledig verslag te geven.
Daarom zal ik me vergenoegen deze betreffende de bacteriophaag uiteen te zetten. Het zijn ten andere deze onderzoekingen waarvoor mij in 1931 de vijfjaarlijkse prijs voor geneeskunde werd toegekend.
De bacteriophaag is door Twort (1915) en d'Herelle (1917) ontdekt geworden. Deze geleerden hadden vastgesteld dat de filtraten van zekere kulturen de hoedanigheid hadden om de groei van bepaalde mikroben min of meer lang te beletten.
Volgens d’Herelle was deze hindernis te wijten aan een virus dat in de mikroben indrong om er een ziekte te verwekken.
Professor J. Bordet vatte het verschijnsel anders op : volgens hem verwekten deze filtraten een beschadiging van de mikroben, die de voortbrengst van een autolytisch ferment tot gevolg had.
Wij hebben steeds de bacteriophagen als virussen beschouwd en wij hebben o.a. vastgesteld :
1° dat niet, volgens de opvatting van d’Herelle, e´e´n bacteriophaag bestond die zich kon aanpassen aan de verscheidene mikroben, maar dat er veel bacteriophagen waren die zich van elkaar onderscheiden zoals de mikroben. Wij zijn tot deze opvatting gekomen omdat de mikroben die weerstandig geworden waren tegenover een bepaalde phage, in hun groei nog konden verhinderd worden, zoals de normale mikroben, door een ander phage. Gezien deze vaststelling zich ook in tegenovergestelde richting voordeed, moest men de veelvuldigheid der phagen aannemen. Om U dit gemakkelijker te laten begrijpen zal ik doen opmerken dat wij in 1921 twee phagen hadden die gedurende 48 uur de groei van eenzeIfde typhuskultuur in bouillon beletten. De typhuskultuur die weerstandig geworden was tegenover de bacteriophaag L. (en dus in de aanwezigheid van deze groeide als op een normaal midden) was in haar groei verhinderd door de bacteriophaag St. Daar wij hetzelfde konden vaststellen in tegengesteide richting (d. w. z. de typhuskultuur, weerstandig geworden tegenover St., was in haar groei verhinderd door de bacteriophaag L.), kon dit feit slechts verklaard worden door de veelvuldigheid van de phagen.
Had zulks zich alleen in e´e´n richting voorgedaan dan had men de waarneming kunnen uitleggen met aan te nemen dat e´e´n van deze beide phagen actiever was dan de andere ; gezien nu de hindernis in de groei zich voordeed in beide richtingen kon men dit enkel verklaren door aan te nemen dat deze beide phagen verschillend waren, de ene van de andere, zoals de typhuskultuur verschillend is van de paratyphusbacil.
De personen, genezen van een typhuinfectie (Ebertbacil), zijn niet meer vatbaar voor deze mikroob, maar kunnen nog geïnfecteerd worden door paratyphusbacillen, evenals deze, genezen van paratyphus nog een typhusinfectie kunnen opdoen, eenvoudig omdat we hier te doen hebben met twee verschillende mikroben.
We hebben ook nog de verscheidenheid der phagen bewezen door de neutralisatieproeven.
Een dier, ingespoten met de phage L., levert een immuunserum dat deze phage zodanig neutraliseert dat de mikroben in hun groei erdoor niet meer gehinderd zijn. Dit verschijnsel is ook specifiek, zodanig dat het immuunserum slechts die bacteriophaag neutraliseert die voor het immuniseren gebruikt werd.
De weerstandigheid van de phagen tegenover het verwarmen pleit ook voor hun veelvuldigheid. Geleerden hadden in hun proeven uiteenlopende resultaten bekomen : de ene beweerde dat de phagen door verwarmen op 60 graden gedurende e´e´n uur vernietigd waren ; anderen vonden dat de weerstand groter was en de phage verwarming op 70 graden kon verdragen. Wij hebben deze uiteenlopende resultaten verklaard door vast te stellen dat al deze proeven niet met e´e´n en dezelfde phage uitgevoerd werden.
2° De menigvuldigheid der phagen moest noodzakelijk als gevolg hebben dat de bacteriophaag die men afzonderde met de gewone technieken (1) dikwijls een ingewikkelde samenstelling bezat. Wij hebben dit o.a. vastgesteld door neutraliseringsproeven. Een serum verkregen bij dieren, geïmmuniseerd tegen de bacteriophaag A, neutraliseerde deze evenals een andere phage, die wij bv. aanduiden als B. Deze laatste, ingespoten bij het konijn, leverde een neutraliserend serum tegenover de bacteriophaag B, maar niet tegenover de phage A. Dit kan men verklaren indien men aanneemt dat de bacteriophaag A een ingewikkelde samenstelling had en o. a. de bacteriophaag B bevatte.
(1) Om een bacteriophaag af te zonderen kweekt men b.v. spoelwater in bouillon. Na 24 uur broeikast wordt de zo verkregen kultuur gefilterd door ecn porceleinen filter, die de mikroben weerhoudt en de phagen (virus) doorlaat. Dit filtraat bezit de bovenvermelde hoedanigheden : het belet de vatbare mikroben, ten minste tijdelijk, in hun groei.
Deze ingewikkelde samenstelling van zekere bacteriophagen is ook bewezen door verwarmingsproeven, de bacteriophagen immers die op 65 graden gedurende e´e´n uur verwarmd werden vertoonden dikwijls een eenvoudigere samenstelling dan de phagen op lagere temperatuur verwarmd : omdat door deze hogere verwarming sommige gevoelige principes vernietigd werden. Om deze reden was het immuunserum verkregen door het inspuiten van dieren met deze, aan hogere temperatuur verwarmde phagen, niet in staat de oorspronkelijke phage te neutraliseren. Wij voegen hier terloops aan toe dat wij ook nog een techniek aangeduid hebben om de phagen in kulturen te tellen. Hun getal schommelt gewoonlijk tussen 10 millioen en 100 millioen per kubieke cm. Overtreft men de verdunning waarin per kubieke cm. geen phage meer gevonden wordt, dan zal men nog in de ene of andere kubieke cm. van deze verdunning phagen vinden en dit, omdat de phagen corpusculaire elementen zijn, die eens de maximale verdunning overschreden, zich niet meer homogeen kunnen verspreiden.
3° Door onze onderzoekingen konden we eveneens de zelfstandigheid der phagen vaststellen.
Zo bijvoorbeeld, een phage, gekweekt in symbiose met colibacillen, blijft dezelfde wanneer ze samen gekweekt werd met gans andere mikroben, typhusbacillen, paratyphusbacillen, paradyssenteriebacillen, enz. Dit zou zich niet voordoen moesten de phagen, zoals Professor J. Bordet het beweerde, een secretieproduct zijn van de microben ; dan zou hun hoedanigheid zich wijzigen in verband met de afkomst van de mikroben, wat het geval niet is als de phage zelfstandig blijft. Zo hebben wij ook met de mikroben, die dieren infecteren en die hun zelfstandigheid behouden ook wanneer ze personen infecteren. Al deze waarnemingen hebben veel bijgedragen om de opvatting « bacteriophagen-virus » te doen aannemen.
Wij hebben ten andere nog andere vaststellingen gedaan om daze opvatting te staven. Wij hebben o. a. geconstateerd dat de phagen aanpassingsvermogen bezitten tegenover schadelijke invloeden, zoals verwarming op hoge temperaturen, zoals inwerking van geconcentreerde glycerine. Aanpassingsvermogen nu is wel een kenteken van iets dat leeft.
Laten we er nog aan toevoegen dat, sedert de electromiscroskoop in voege is, men ook de veelvuldigheid van de bacteriophagen heeft kunnen vaststellen.
Ten andere deze opvatting past goed in de algemene biologie. Het ware een eigenaardig verschijnsel moesten er in de natuur slecht ziekte-verwekkende virussen voor mensen, dieren en planten bestaan. Voor enkele ziekte-verwekkende mikroben hebben wij talrijke saprophytische kiemen die de mens nuttig zijn, zelfs onontbeerlijk voor zijn bestaan.
De bacteriophagen zijn nu die saprophytische virussen die ons ook nuttig zijn. Men moet nochtans hun rol niet overdrijven, zoals d’Herelle het deed, en de genezing van de ziekten uitsluitend toeschrijven aan de phagen. Volgens d’Herelle zouden de immuunstoffen die zich gedurende het verloop der ziekte vormen niet de oorzaak zijn der genezing maar een gevolg ervan. Alhoewel wij de bacteriophagen in zekere gevallen als nuttig voor ons beschouwen, hebben wij toch nooit deze overdreven opvatting aangenomen. Zeker vervullen de phagen een belangrijke rol in ’t vernietigen van de ziektekiemen die met de uitwerpsels verspreid worden op de aarde, in ’t water, enz., met andere woorden, in de zelfreiniging die in de natuur geschiedt.
Articles from Bacteriophage are provided here courtesy of
Landes Bioscience